שאלות נפוצות על תאים שבורים

1. E. coli מבטא חלבון זר. כאשר sonicated, הוא מושעה PBS המכיל 1% triton-X-100. ההשפעה של אולטרסאונד עדיף. ההשפעה של 1% triton-X-100 עדיין ברור. כמה חיידקים אחרים גם לעבוד, כגון Streptomyces. לאחר הבעת החלבון הרקומביננטי, התאים השתבשו על ידי הפרעה בתא קולי, תוך שימוש באמבט קרח, 400w, ונמחץ עבור 2s עבור 1s, אבל כמות גדולה של קצף נוצרה בתוך זמן קצר, אשר השפיעו על כוח ריסוק. שני קופסאות ואגוזים היו כך. האם הפיצול אינו שלם, וחלבון המטרה נמצא בתאים בלתי רצופים אלה, מה עלי לעשות?

ניתוח: הבועה תיווצר כי המיקום בדיקה אינו ממוקם היטב; בדיקה חייב להיות קרוב לתחתית, על 0.5-1cm; הכוח ישתנה בהתאם למכשיר, אך ניתן לראות את רמת הנוזל, יש תנודות אך לא חזקות מדי; אתה יכול לבחור תאים קולי מגרסה שבורה עבור 3s עבור 10s ושברו 20-30 פעמים. יש לציין גם את מקום הצופר. אם הצליל לא בסדר, זה צריך להיות מותאם בזמן; בהתחשב בריכוז של חיידקים. נסו להגדיל את עוצמת הקול בעת ריסוק, את הכוח של Zui לא יעלה על 60%; מנסה לשבור 8s עבור 8s, עבור כמה חלבונים חיידקים, קשה להפיג את החלבון לגרום denaturation חלבון לייצר בועות, אשר יכול להיות מושהה למשך קצת יותר. חלבון שנמצא בצורה של גופים הכללה.

2. מה הם התנאים עבור sonication של Streptomyces (actinomycetes)?

אנליטית: actinomycetes שייכים לאחוז (G + C) של טוחנת (mol%) של קבוצת ההסתעפות החיובית (Eubacteria) על העץ הפילוגנטי של המערכת הפרוקריוטית, בעלת מאפיינים מולקולריים וביולוגיים ייחודיים לפרוקריוטים. עם זאת, בקבוצות שונות, ההרכב הכימי של הקיר התא משתנה מאוד. ב אולטרסאונד E. קולי, 400W משמש, ואת שיטת שבירה 5s עבור 5s יעיל, אבל הוא משמש על Streptomyces, ואין לה השפעה בשל ההבדל הרכב הקיר התא. טיפול טרום ספינינג של Streptomyces (actinomycetes) מוגדר בדרך כלל ריכוז מסוים ההשעיה חיידקי. התנאים הספציפיים עבור ריסוק באמצעות משבש תא קולי הם: איסוף החיידקים בתרבות 24 שעות תרבות ב 5 000 r / min במשך 5 דקות לאסוף את התאים; כביסה עם pH 7.5 Na2HPO-חיץ NaH2PO 3 פעמים, ולאחר מכן התאים היו מנוסחים לתוך ההשעיה חיידקי 1: 3 באמצעות המאגר. ממוקם בתוך צינור פלסטיק גדול 40 מ"ל הבדיקה; מניחים את המבחנה פלסטיק גדול הבדיקה באמבטיה קרח לרסק אותו עם המפרק תא קולי (כוח 200W, 1/2 "בדיקה, למחוץ במשך 30s, 30s לסירוגין), ריסוק פתרון ב 12 000 r / min צנטריפוגה במהירות גבוהה עבור 30 דקות, לאסוף פסולת התא supernatant.תרחיץ תאים ניתן גם שטף פעם עם מלוחים מראש או Tris-HCl ב pH 8. בנוסף, המינון קולי משתנה מאוד עם כמות המדגם וחיידקים.הכוח יכול להיות 400- 600w, מרוסק עבור 5s, עצר 5s, אמבט קרח, הריכוז הסופי של 1 מ"מ PMSF הוא הוסיף.על מנת לקבוע את עוצמת הקול המתאים תדירות, יש צורך לבדוק אם החיידקים שבורים לחלוטין בכל עת.